㈠ 電影理論的本體論
第二次世界大戰後義大利新現實主義電影的勃興使電影理論空氣為之一變。以法國的A.巴贊和美國的S.克拉考爾為代表的紀錄派理論從50年代起取得了堪與蒙太奇理論相頡頏的地位。
巴贊首先是一位影評家，但他的影評文章超出了實踐的性質，具有重要的理論價值。他留下的大量電影論文被編選成 4卷集《電影是什麼？》。
巴贊的電影影像本體論和長鏡頭理論（或稱場面調度理論），是他的理論體系的基礎和核心。
電影本體論力求證明電影的「本體」實質，電影和存在、電影和現實的聯系。持有本體論觀點的重要代表人物除巴贊和克拉考爾外，還有美國的O.帕諾夫斯基和S.卡維爾等，但其中以巴贊和克拉考爾的理論體系為最完整、最有影響。
巴贊認為，電影本質上是「真實的藝術」。他在選集的序言中指出：「我們必將從照相影像開始，它是最後的綜合體的基本元素，然後以此為起點，簡略地提出一種關於電影語言的（哪怕算不上理論，也至少是）分析，其立論基礎是假定它具有內在的真實性。」
巴贊論證說，照相術的發明使人類長期以來企圖創造出一個符合現實原貌、而時間上獨立自存的理想世界的願望得到了實現。因此,從繪畫過渡到照相術時,最本質的現象是心理因素，它完全滿足了把人排除在外、單靠機械的復制來製造幻象的願望；人們終於獲得了一門「有了不讓人介入的特權」的藝術。以照相術為基礎的「電影這個概念與完整無缺地再現現實是等同的，他們首先考慮的是再現一個聲音、色彩、立體感等一應俱全的外部世界的幻景。」
巴贊從義大利新現實主義電影中找到本體論理論的最好實踐例證，指出藝術家真實地再現現實並不等於放棄自己的創造任務。因為傳達關於人和社會的實況並不比傳達主觀視像更容易些：「藝術中的『寫實主義』形式向來都首先是具有深刻『審美意義』的形式。……在藝術中，現實如同想像一樣，是藝術家獨有的財富，而把現實的具體內容體現在文學或電影作品之中，並不比體現想像的最離奇的夢幻更容易些。」
在電影本體論的基礎上，巴贊構築起他的長鏡頭理論大廈。這一理論的兩個中心論點是：①反對蒙太奇至上論。②強調現實的多義性。
巴贊激烈地反對愛森斯坦等人的蒙太奇理論。他指出,電影從蒙太奇開始才成為一門藝術的名言,曾暫時起過積極作用，但它的效能已經發揮殆盡。蒙太奇是文學性的和最反電影的手段。電影的特性就其純粹狀態而言，相反地正在於攝影上嚴格遵守空間的統一性。但是他並不絕對反對使用蒙太奇，而認為蒙太奇在電影中只是在這樣的情況下才是必要的：創造必要的不真實性。這是因為電影的一部分功能是使觀眾享受幻想的樂趣，如果太真實，就完全排除了幻覺。因此，他覺得可以提出下述原則作為美學的規律：在必須同時表現動作中兩個或若干因素才能闡明一個事件的實質的情況下，運用蒙太奇是不能容許的；一旦動作的意義不再取決於形體上的接近，運用蒙太奇的權利便告恢復。巴贊的蒙太奇界限論是以現實的多義性為依據的。他指出，現實是多義的，而蒙太奇從根本上反對多義性，這是由它的本性決定的。
巴贊強調現實的多義性是為了要求影片創作者通過選擇來突出事件的含義。他認為，電影敘事單元不是鏡頭，而是事件，這是具體現實的片斷，而現實本身是多面的、多義的，一個事件的確切含義是在悟出它與另一些事件之間的聯系後才能逆推出來。他還認為，雖然電影確實大抵只能從外部把握它的對象，但是它有千百種手段去處理客體的表象,能清除所有模糊的含義,使事物表象成為反映一種單一的內心現實的符號；銀幕形像存在的前提是情感與情感的外部表現之間具有必要的、明確的因果關系。
巴贊認為，從多義的現實事物中「悟出」其「確切的含義」的人，應當是觀眾。而要做到這一點，觀眾在看電影時就必須對畫面的內容有選擇的權利。只有不被剪斷的景深鏡頭才能給予觀眾這一權利。巴贊以O.威爾斯的影片為例，指出，這位導演在《公民凱恩》里用景深鏡頭來刺激觀眾，這種技巧迫使觀眾去使用他們自由的注意力，同時也使他們覺察到事實的多重矛盾，這就使其景深鏡頭具有三重的真實，即本體論的真實、戲劇的真實和心理的真實。他稱贊《安倍遜大族》，認為其鏡頭段落絕不是僅僅消極地拍下同一場景中的動作，它拒絕分割事件，拒絕按空間分解劇情發生的地點，這是一種積極的手法，其效果比經典的分鏡頭可能產生的效果更要好得多。
S.克拉考爾是另一位原為德籍的美國電影學者。他採納了巴贊的理論前提，根據自己40多年的「觀影經驗」，寫出了《電影的本性》(1960)，把紀錄派理論發揮到了極至。
克拉考爾說，他的電影理論是一種「實體的美學」，而不是形式的美學。他關心的是內容。他的立論基礎是：「電影按其本性來說是照相的一次外延，因而也跟照相手段一樣，跟我們的周圍世界有一種顯而易見的近親性。當影片紀錄和揭示物質現實時，它才成為名副其實的影片。」
和巴贊一樣，克拉考爾也拋開了傳統的藝術觀念來看待電影，但比巴贊走得更遠。他斷言說，傳統藝術觀念「並不、也不能適用於真正『電影化』的影片」，因為傳統的藝術是「從上層到基礎」，即從思想意圖出發來消化物質現實材料，而唯獨電影是「從基礎到上層」，即從對物質現實的如實反映開始，最後走向某個問題或信念。因此，「如果電影是一門藝術，那麼它便是一門不同於尋常的藝術」，「是唯一能保持其素材的完整性的藝術。」
克拉考爾的理論目的是通過對各類電影的審查，找出一條最符合電影本性的發展電影的路線為此,他詳盡地分析了電影的材料與方法，摒斥了一切「非電影化」的形式和內容。樹立起他的「電影化的」標准，最後在人類活動的總的背景上論證了電影的規律和可能性。
克拉考爾用「物質現實的復原」來概括他的「電影化」的概念。為了達到「復原」的目的，他只允許電影發揮「紀錄」和「揭示」兩種功能，而排斥一切經過藝術家設計的、有明確思想意圖的、在故事結構上有頭有尾的影片。即使是純視聽形式的實驗影片也在受排斥之列，因為在他看來，這種影片固然傾向於避免講述故事，但它們在這樣做時卻很少考慮電影手段的近親性，忽視攝影機面前的現實；它們廢除了故事的原則，只是為了樹立藝術的原則，在這次「革命」中也許藝術得到了好處。電影則一無所得。
在克拉考爾看來，最「電影化」的形式和內容是「找到的故事和插曲」。所謂「找到的故事」有3個特徵:①它是被發現的，而不是被構想出來的；②它是自然素材的一個重要的潛在元素，很少有可能發展成一個獨立自在的整體；③它能再現出我們周圍世界中一些典型的偶然事件，使其通過攝影機的揭示而從生活流中實現出來，繼而又消失在生活流中。
克拉考爾深深意識到，他給電影規定的嚴格的價值標准必然會遭到反駁，因為他對一切「非電影化」的題材的排斥，除了依靠他自己對電影的獨特信念和熱情外，無法在電影理論范圍內找到任何根據。於是他便轉而在人類思想和活動的變遷這一更為廣闊的背景中論證他的電影功能論。克拉考爾認為，看電影的意義在於使現代人有可能經驗物質現實，把注意力從內心世界轉移到生活的外部現象上來。現代人非常需要這個「轉移」，因為他們患了「思想空虛症」和「認識抽象症」。他認為，人的內心世界和外部現實之間的關系在過去3或4個世紀中已經發生了深刻的變化。其中有兩個變化是特別值得注意的，一是共同的信仰漸失人心，一是科學的威信穩定上升。由於現代人不再有共同的信仰，他們對理性的作用發生了懷疑，趨向於反理性主義；另一方面，科學的發達導致人們「把現實現象數學化」，把事物的具體的物質內容化為抽象的認識。這兩者最後使觀代人成為對觀實漠不關心的「孤獨的人群」。唯有電影才有可能幫助人們「通過攝影機來經驗這個世界」，使它從冬眠狀態中、從虛假的不存在狀態中徹底恢復活力。
J．米特里 在對電影進行整體性研究的最新一位代表人物是法國的電影教授 J．米特里。他的兩卷本著作《電影的美學和心理學》出版於1963年。其中廣泛地論述了50年來電影理論所涉及的一切問題，評述了多種不同的論點，有明顯的綜合性質。根據法國電影研究家C.麥茨的概括，米特里在他的著作中主要論述了10大問題：①現代電影；②主觀鏡頭；③電影中的有聲語言；④電影音樂；⑤電影中的彩色；⑥純「視聽」影片；⑦電影對戲劇程式的逐漸擯棄；⑧電影與戲劇；⑨電影與小說；⑩隱喻、象徵、語言。
米特里的綜合性理論的一個重要目的在於對以愛森斯坦為代表的蒙太奇理論和以巴贊為代表的本體論理論進行批判性的調和。他對影片作了歷史性分類，即「蒙太奇」影片和「時空連續拍攝」影片，認為這是電影表現手段的兩大形態，但不是水火難容的。指出這兩種美學的對立只是強調了在電影手法上存在著兩種形式的差別。一種形式在電影中相當於詩的語言，另一種形式相當於小說的語言。顯然，兩者遵循的原則是不同的。不論小說家要說什麼，總是躲在主人公身後，隱藏在表面的真實性之後，他的一切努力就是旨在創造或再創造這種真實性。詩人則不然，他直接表達思想，他和事實一起，而不只是通過事實來說話。米特里更傾向於蒙太奇理論。他說：「我們首先要反對一種傾向，這種傾向為了捕捉住『真正』的現實，想把電影變成一種純粹紀實的手段,一種紀錄行為的機器。在一定程度上,電影是紀實的,但幸而它並不完全如此,因為它存在的條件絕對不讓它這樣。當電影純粹紀實時，它必然損害藝術。」他批評巴贊在反對蒙太奇理論時「似乎總是選擇壞影片中一些表現手法加以攻擊和貶斥」，「這種做法導致他把表現方法的應用不當歸罪??需的。但他反對「把蒙太奇效果視為電影表現形式的核心。」「把它視為一般美學的基礎，而不是僅僅把它當作表達個人風格的手段」。他指責了愛森斯坦早期著作中的「雜耍蒙太奇」理論，強烈反對把蒙太奇手法同語言進行類比。他認為電影中的每一個抽象意義都必須植根於我們的真實感覺，想要利用蒙太奇來擔負語言的工作以傳達抽象的概念，那是對電影媒介的誤用。為此，他詳細列出了各種不同的蒙太奇，指出哪些是合適的，哪些是有違於電影的本質的。
電影理論中的結構主義－符號學電影理論的最新發展形態是結構主義－符號學的電影研究。這種研究方法的代表人物克里斯興?麥茨認為,在米特里之後,電影理論應當進入「第二時期」，從全面的、概括性的研究轉入精確的、科學性的局部的研究，即建立結構主義－符號學電影理論。
在電影研究中把結構主義和符號學相提並論，一是因為，一些結構主義者，如麥茨、 P.沃倫、 B.尼柯斯、U.艾柯和克莉思托娃等，本人就是符號學家，他們的工作主要就是對電影作符號式的分析；二是因為一般性的符號學研究中往往摻雜一些結構主義哲學的因素。
結構主義-符號學電影理論主要有兩個方面,一是對電影作一般的理論研究,力圖給電影建立科學的基礎;二是運用這個科學對具體影片進行結構主義式的「讀解」分析。麥茨的著作《論電影中意義的顯現》(卷1,1968；卷2,1972)和《語言和電影》(1971)等是最有代表性的。
麥茨把電影研究分為兩種,一是廣義的電影研究,這包括電影和其他活動之間的關系、可能產生的所有問題，如技術、工業組織、電影檢查、觀眾反應、明星崇拜等。廣義的電影是社會學、經濟學、社會心理學、精神分析學、物理、化學的研究對象。二是狹義的電影研究，僅指電影本身，不涉及影片製作的復雜程序和電影引起的種種現象。結構主義－符號學電影理論即只限於對電影動力的內在研究,是一種「尋求意義的科學」,即研究電影如何將其內含的意義傳達給觀眾，並為這種傳達制定一個清楚的模式，找出構成電影經驗的規律。
麥茨認為，電影的核心是「意義的顯現」，即「經由符號系統來理解影片所傳達的信息的人為過程」。電影的「意義的顯現」的特性決定於電影的獨特的「表現材料」。它既非現實本身，也非蒙太奇，而是「 5個材料頻道」：①多樣的活動攝影影像；②我們在銀幕之外看到的一切文字資料;③錄下的語言；④錄下的音樂;⑤錄下的噪音和音響效果。電影結構主義－符號學的任務就是分析這些「材料頻道」的「混合的意義」。
麥茨反對把電影說成一種語言，他否認電影有任何「文法」可言，但他贊成用語言學的原理來研究電影，並採用了一系列語言學的術語，如「符碼」、「信息」、「系統」、「符體」、「並列組合」等，其中最關鍵的術語是「符碼」,它是符號學的主要研究手段所謂「符碼」並不存在於電影中，它是信息據以傳達的邏輯關系，是符號學者研究了一系列影片後將影片中起作用的規則加以歸納整理編造而成的。所以「符碼」是「表現材料」發生意義、發出信息的邏輯形式。符號學就是根據編出的「符碼」（表演、燈光、走位、攝影機運動）還原影片中的信息的。
麥茨認為「符碼」有 3個基本特性：一是「獨特程度」,如「平行蒙太奇」是電影的獨特「符碼」,為其他藝術所不可能有。二是「不同的普遍性層次」，如全景鏡頭屬最普遍層次，但西部片中的牛仔褲、西部景物屬特殊層次。三是「會下降為次符碼」。「次符碼」是對「符碼」的一種用法。在不同時期的不同影片里，「獨特符碼」和「普遍符碼」都會有不同的用法。根據這一解釋,電影結構主義-符號學作為一般性理論研究就要分析每個「符碼」的「獨特程度」、「普遍程度」和「符碼」間的相互作用；當用於對具體影片的「讀解」分析時，則要指出無數「符碼」在作品中系統地安排和交結的情況。因此,麥茨說:「電影是所有符碼加上其次符碼的總和」，這個「總和」能從電影的「表現材料」中製造出「意義的顯現」，電影理論就是贊成某些「符碼」而反對其他「符碼」的「檢查制度」。而電影史就是由過去採用過的「次符碼」組成的。
㈡ 3. 蛋白質譜的原理及使用（2）
說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由中國農業大學生物學院的李溱老師所授。
我們作為質譜儀的使用者，怎麼來評估一台質譜儀的性能呢？或者說，我們如何選擇質譜儀呢？質譜儀主要的性能參數如下圖，就讓我來依次為大夥兒解釋一下這些高大上的參數名稱到底是啥意思吧。
「官方」的定義是，與三倍噪音相當的物質的量，我們可以理解為這是質譜儀能夠檢測到的最低含量化合物的濃度，或者量。比這個值再低的化合物，這台質譜儀就無能為力了。
我怎麼知道我的質譜儀的檢測限是多少呢？通常，我們會用利血平來作為一個標準的化合物測定質譜儀的檢測限。比如，當我們在質譜儀中注入50 fg（飛克）利血平，如果我們獲得的信噪比能達到100-1000，那麼可以認為這台質譜儀的檢測限是不錯的。50 fg（飛克）利血平中大概只包含了幾萬個利血平分子，也就是說，如果能實現對含有幾萬個小分子的化合物進行檢測，那麼這台質譜儀的靈敏度是挺高的了。大家可以認為，靈敏度與檢測限評估的是同一種性能。
這個性能參數也是挺重要的。它表示在什麼樣的濃度范圍之內，質譜儀檢測到的信號與樣品濃度之間成線性的關系。說得簡單點，就是這個濃度范圍內的樣品，用這台質譜儀檢測是比較合適的，高於或低於這個濃度范圍的樣品，需要濃縮或者稀釋後才能用這台質譜儀檢測。
通常情況下，質譜儀的線性范圍是在3-6個數量級，也就是1,000 – 1,000,000這個范圍之內。大部分質譜儀是在1,000 – 10,000這個范圍內。
這個參數之所以重要，是因為當我們分析的樣品含量分布非常廣的時候，比如有的樣品含量只有幾十μg/ml，而有的樣品含量可以達到幾mg/ml。在這個比較寬的濃度范圍內，如果質譜儀的線性范圍非常好，我們不需要濃縮低濃度的樣品，也不需要稀釋高濃度的樣品，可以直接進樣，這樣可以大大減少樣品前處理的復雜程度，很好地節省時間，節省實驗步驟。
這是兩個非常重要的參數，我們常說的高分辨質譜，指的就是解析度特別高，且質量准確度特別高。這兩個參數怎麼理解呢？我們先來看看下面這個圖：
就是質譜儀可以分辨的最近兩個質譜峰的質量差值。
這是啥意思呢？假設我有兩個強度相同的質譜峰，當這兩個峰很靠近的時候，我在什麼情況下可以明確地判斷出這是兩個峰，而不是一個呢？基本准則就是，這兩峰的重疊部分的高度，不超過任何一個質譜峰峰高10%的時候，我們認為這是兩個可分離的峰。反之，如果這兩個峰重疊的部分超過10%，就認為是不可分離的，也就是說，在處理質譜圖時，是沒辦法按照兩個峰值來處理的。
當兩個峰實現10%基線分離時，我們來測定任何一個質譜峰的半峰寬（就是峰高一半處的峰寬），然後用任何一個峰的質荷比除以半峰寬，就可以得到解析度。目前來講，高分辨質譜儀的解析度可以達到50,000-100,000的數量級，一般的四級桿可以達到5,000-10,000。
那麼，高分辨質譜的優點如何體現呢？以上面的右圖為例，當我們用低分辨質譜儀檢測某種物質時，只能得到最外面藍色的一個質譜峰，當我們不斷提高解析度，會慢慢發現，這一個質譜峰裡面，其實包含了若干小的質譜峰，高分辨質譜儀得到的質荷比與低分辨獲得的質荷比是有非常明顯的差異。這對化合物鑒定來講，是很重要的信息。如果我們把質荷比都算錯了，我們是很難鑒定到正確的蛋白的。
下面這個圖也能很直觀地告訴我們質譜檢測高解析度的優勢。
比如說，我們用17,500的解析度來對一個化合物進行掃描，會發現在質荷比在280.09的這個位置，有一個非常胖的質譜峰（第一張譜圖紅色圓圈標記），我們可能會認為這是一個化合物，於是就開始對這個化合物進行鑒定。可是，當我們不斷提高質譜儀的解析度，到一定程度時，我們會發現，這其實是兩個不同的峰（第四張譜圖紅色圓圈標記）。
也就是說，用低解析度質譜里得到的質荷比來鑒定化合物，得到的信息其實是不完全的（不一定是錯的），而通過高分辨質譜，我們就能獲得更全面的化合物信息，幫助我們做出正確的判斷。
是指質譜儀測到的質荷比與它實際的質荷比的差值，除以它真實的質荷比與1,000,000的乘積。所以它是以ppm為單位的（百萬分之一），這個數值看起來更方便。目前高分辨質譜儀質量准確度在2-5個ppm的范圍之內。
那麼，我們怎麼來測定一個質譜儀的實際解析度及質量准確性呢？以李溱老師的一個實驗數據為例：
比如，我們選質荷比是511.6這個峰，計算出它的半峰寬為0.012，於是它的解析度就是511.6除以0.012，得到的值為42,500，而軟體給出的解析度是48,700，是很接近的。
同樣的例子，我們來計算質量准確性。測到的質荷比是511.5978，而這個峰實際的質荷比是511.5995，於是計算出質量偏差為3.3ppm，也就是說此次實驗的誤差就是3.3ppm，這么一個質量偏差范圍通常是可以接受的。
解析度的重要性可能大夥兒容易理解，那質量准確性的高低到底對化合物鑒定會有怎樣的影響呢？我們還是以利血平為例。
利血平分子，在質譜圖中的609.28066處會有一個質譜峰。當我們用單四級桿來分析利血平的時候，單四級桿的質量准確性大約是在0.1個質量單位（165ppm）。也就是說，當把利血平注入一個四級桿質譜中，四級桿質譜會告訴我們，這個化合物的質荷比大概是在609.2-609.4這個范圍之內。
那麼問題就來了！在609.2-609.4范圍內，我們用C、H、O和N四種元素可以組合出多少種在化學上可以存在的化合物呢？答案是：209種！也就是說，我們要判斷這個化合物是不是利血平，得出正確結果的可能性只有1/209！
當我們將質量准確性不斷提高，可以組合出來的可能的化合物就會越來越少。當質量准確性達到3 ppm的時候，只有4種可能的化合物。當達到2 ppm的時候，得到的可能的化合物就只剩下2種了。這時候我們再來判斷化合物是不是利血平，那麼准確性就會高很多很多。這就是為什麼高分辨質譜儀對於化合物鑒定來說非常重要，它可以大大減少候選化合物的數量，提高鑒定的成功率。
可以這么說，解析度與質量偏差分別評估了質譜儀的精密度與准確性。就像我們打靶，比如我每次都能打到右上角一個點上，說明打靶的精密度非常高，但如果我的目標是靶心，那說明准確性卻比較差。另一種情況，比如我打靶很多次，打中的點很分散，東一槍西一槍，但平均起來的位置剛好在靶心上，可以認為質量准確性還可以，但精密度比較差。所以我們希望的是，質譜儀的精密度和准確性都非常高。
目前我們能用到的高分辨質譜儀，不管是QTOF或者Orbitrap系列，都可以達到50,000以上的解析度，同時也可以達到2-3ppm的質量准確性。所以說，如今做蛋白質組學研究的童鞋們，比起以前，真是幸福了很多！
前面給大夥兒分享了評估質譜儀的幾個重要參數。那接下來我們就針對不同質譜的性能做一個粗略的總結。
1、 四級桿和離子阱 ：它們的質量掃描范圍是有限的，通常情況下是在10-4,000。超過4,000，四級桿和離子阱就只能作為離子傳輸用，而不能用於離子檢測了。它們的解析度通常是2,000-4,000，好一點的離子阱可以達到10,000-20,000。掃描速度都不是很快，它們的優勢是價格非常低，而且整個儀器可以做得非常小。
2、 TOF ：它最大的優勢是可以測量的質量范圍理論上可以無限大和無限小。如果待檢測的離子沒有質量，那麼它的飛行時間將是0，於是可以測到質荷比是0的離子。同理，如果離子的質量是無限大的，那麼它的飛行時間也是無限長的，理論上也是可以檢測的。TOF的解析度是5,000-60,000，掃描速度非常快，它的缺點是，TOF需要一個非常長的離子跑道，所以儀器的體積會很大。
3、 FTICR ：優勢是解析度非常高，可以達到1,000,000甚至更高，缺點是掃描速度比較慢，而且它需要一個超導磁鐵，運行費用非常高，而且FTICR質譜儀本身的價格也很高，通常都在100萬美元以上。
4、 Orbitrap ：克服了FTICR必須要使用超導磁鐵的缺點，它的解析度可以達到100,000到1,000,000萬，掃描速度不是很快，價格比FTICR要低一些。它受專利保護，目前只有Thermo公司可以生產。
對於蛋白質組學研究來講，我們對質譜儀器性能的最低要求是：解析度至少在40,000-50,000，質量准確性應該優於5ppm，質量掃描范圍應該在100-3,000，掃描速度是每秒至少獲得一張高分辨的一級譜圖和十張高分辨的二級譜圖。達到以上條件的話，就算是滿足了我們做蛋白質組學最基本的要求。
上面講到各種質譜儀的優缺點，那麼我們這里引入串聯質譜的概念：將相同或者不同的質譜儀串聯起來，實現串聯或者並聯工作。這樣做的目的有兩個：產生二級碎片離子（為什麼要產生二級碎片離子我們後來會講），以及實現不同質譜儀性能的優勢互補。
我們知道，不同的質譜儀性能是不同的。比如說，四級桿質譜可以實現離子選擇，但它的解析度比較差，而TOF不能實現離子的選擇，但解析度比較高。那麼我們能不能把不同性能的質譜儀串到一起，讓它們協同工作呢？我們通常會利用串聯質譜或者MS-MS來實現這個需求。它們的結合方式有很多種：
第一種：三重四級桿（Triple Quadrupole），或者串聯四級桿，就是把三個四級桿串聯起來，這樣做的主要目的是為了實現二級質譜的掃描。
第二種：四級桿和飛行時間質譜儀串聯到一起，就是我們經常聽到的Q-TOF，它實際上是為了提高二級質譜的解析度。
第三種：Orbitrap與四級桿組合，比如Orbitrap Fusion，或者Orbitrap與離子阱組合到一起，比如說Orbitrap Elite等，就是這樣的組合。
首先，我們聊一聊怎麼通過串聯質譜儀獲得二級碎片離子。
上面是一個串聯四級桿結構的示意圖。串聯四級桿，或者叫三重四級桿，它是由三個四級桿串聯起來。通常，第二個四級桿是由六級桿或八級桿來代替，但我們還是叫它四級桿。這個四級桿不是一個質量選擇系統，而是一個collision cell，即碰撞池，用來碎裂離子。
當串聯四級桿工作的時候，第一個四級桿是開啟了質量選擇的模式，它讓特定質荷比的離子穿過質譜儀，而把其它的離子都甩掉（甩到四級桿上，或者甩到四級桿的空間當中去）。然後，當特定的離子被選擇好後（稱為母離子），會進入碰撞池。
在碰撞池裡有這樣一個結構，就是入口和出口存在電壓差，通常入口電壓會高於出口電壓，當母離子進來以後，通過電壓差的作用，就會被加速。而且碰撞池裡會充上氦氣或氮氣，當離子被加速以後，它就會與碰撞池裡的氦氣或氮氣分子發生碰撞、碎裂，形成一些碎片，叫做fragment ions，也就是碎片離子，或者子離子。這些碎片離子會進到第三個四級桿中，進行二級的掃描，得到二級質譜圖。
下圖就是一個串聯四級桿質譜儀，我們可以看到，它仍然是一個非常緊湊的結構。
我們以萊克多巴胺為例，來看看它的分子通過串聯質譜儀，會發生哪些變化，得到怎樣的譜圖。
萊克多巴胺這是一種獸葯。它的分子量是301.1672，結構式見上圖。第一張圖，測出來的質荷比為302.1744，這是一個一級質譜的掃描圖，在302.1744處有一個萊克多巴胺的質譜峰。
然後呢，我們告訴質譜儀，把302.1744處的這個離子挑出來，將CID（碰撞誘導解離）電壓設為10伏，即在碰撞池的入口與出口處增加一個10V的電壓差，讓離子以10V的碰撞能來進行碰撞。碰撞以後，在第二張圖里，我們看到302處的信號強度變弱了，同時284和164的信號強度變強了，原來沒有看到的107、121、136信號也出現了。
接下來，我們把碰撞電壓從10V增加到25V，增加以後我們會發現，302處的信號完全消失了，表明原來在第一個四級桿中被選擇出來的這個離子，經過高能量的碰撞後，完全碎裂了，碎成了91、107、121、136和164這樣一些碎片離子。那麼這些碎片離子都是什麼呢？
我們通過分析結構會發現，它們分別對應著萊克多巴胺的不同的碎片結構，比如164其實對應著萊克多巴胺右端的局部，136對應的是左半部分，等等。
通過分析碎片的化學結構，我們就可以把它們拼裝起來，拼成一個完整的萊克多巴胺分子。這就是我們如何通過二級質譜圖，來實現對化合物的結構鑒定。而實際的鑒定過程常常會更復雜更傷腦筋一些，上面只是一個簡單的示例。
那麼對於多肽，或者說對於蛋白酶解後的多肽片段來說，我們可以通過同樣的過程，通過分析一個多肽理論上可以得到哪些碎片，然後與譜圖進行對比，就可以實現對多肽序列的鑒定。這部分後面會詳細再講。我們先來看個簡單的例子，如下圖：
比如說我們有左上角這樣一個肽段，理論上可以得到灰色標記出的各種b-y離子，通過分析質譜圖，可以從中找到對應的碎片離子（右邊表格里紅色標記的都是可以從質譜圖中找到的碎片離子），通過將這些信息拼裝起來，我們就可以知道多肽的序列是什麼。
上面通過以三重四級桿為例，跟大夥兒分享了串聯質譜儀是如何獲取二級碎片離子及二級譜圖的。那麼，其它一些串聯質譜儀也是類似的過程。
Q-TOF與串聯四級桿其實是非常像的，只不過它把第三個四級桿換成了一個飛行時間質譜儀。也就是說，一個四級桿，接一個碰撞池，然後接一個飛行時間質譜儀。為了增加飛行的距離，我們會讓離子拐個彎再飛回來，這種叫反射模式飛行，讓離子在更短的空間內可以飛得更遠一些。
下面這個圖就是一個Q-TOF質譜儀，是Bruker生產的。它的飛行時間管（flight tube）的長度可以達到3.6米，離子飛一個來回是7.2米。這個數字大夥兒可以留意一下，後面在講真空度的時候，還會再次提到。
Orbitrap系列比一般的串聯質譜儀要復雜一些，大夥兒可以通過下面這個示意圖感受一下。
這個系列有好幾種串聯質譜儀，比如Q Exactive質譜儀，它的Q1也是一個四級桿，Q2是碰撞池，Q3是被一個Orbitrap所取代。
再比如Orbitrap Elite，它的Q1是一個離子阱，Q2是一個碰撞池，Q3為一個Orbitrap，也就是說，Orbitrap Elite裡面是沒有四級桿的，它用一個離子阱代替了四級桿。
還有一款是Orbitrap Fusion（見下圖），它是三種質譜儀混在一些的組合，它的第一級是四級桿，第二級是一個離子阱，第三級是一個Orbitrap，同時它還有一個碰撞池，整體是一個非常復雜的結構。它的特點是，Orbitrap與離子阱可以同步進行掃描。
一般的質譜儀里，兩個質量檢測量是不能同時掃描的，只能是一個作為質量檢測的功能，另外一個作為過濾用。而Orbitrap Fusion里的離子阱和Orbitrap是同時可以進行掃描的，也就是說，它是一個並列的結構，而不僅僅是串聯的，所以它的掃描速度會更快，性能也更好。Fusion的解析度可以達到240,000 – 960,000。
上面我分享了幾種常用的質譜儀，那麼以Q-TOF為例，我們再來學習一下質譜儀的基本構造。
對於質譜儀來說，最核心的部分就是質量分析器，它包括兩個部分，就是前面我們詳細介紹的質量過濾器和質量檢測器。質譜儀所有其它部分都是為這個核心部分來服務的。
除了這個核心的組件以外，質譜儀還需要以下幾個部分輔助：
真空系統 ：為什麼需要有真空系統呢？我們知道，質譜儀是一台檢測氣態離子質荷比的儀器，當一個氣態離子在空氣中飛行時，它會與空氣分子發生碰撞，它帶的電荷可能就會被撞沒了，而成為一個不帶電荷的氣態分子，那麼質譜儀就無法再測量它的質荷比了。所以我們希望得到的這個氣態離子能夠在質譜儀中穩定存在，所以質譜儀需要一個真空系統，讓離子可以穩定地飛行，不受其它空氣分子的干擾。
真空系統通常需要有兩級，一級是低真空，由機械泵或油泵來提供，它可以大概1-3個mbar，也就是千分之一個大氣壓的壓力環境，低真空的目的是為了給高真空提供一個後備壓力環境。高真空是用渦輪泵來提供的，它的真空程度是-1E-5~-1E-10 mbar，在這樣一個真空環境里，空氣分子基本上都被抽干凈了。
可能你想問，為什麼要求這個數量級的真空條件呢？
我們先引出一個概念，叫離子的平均自由程（mean free path），它的意思是，一個離子在一個真空環境中飛行多長的距離會碰到下一個空氣分子。這就決定了離子在真空中可以穩定存在多久。
以串聯四級桿為例，串聯四級桿質譜儀大概有1米長左右，所以我們希望離子在飛行1米的過程中，不要碰到其它的空氣分子。那麼對於串聯四級桿來講，只要維持的真空度能保證1米距離內不會碰到空氣分子就可以了。所以串聯四級桿通常只需要-1E5 mbar的真空度。
而對於Q-TOF來說，離子的飛行距離大概是在5-7米（大夥兒還記得嗎？前面介紹Q-TOF時專門提到了7米這個飛行距離），比串聯四級桿的飛行距離長了將近一個數據級，所以Q-TOF質譜儀要求的真空度大約在-1E-6 ~ -1E-7 mbar，才能保證離子在飛行這么長的過程中，不會碰撞到其它空氣分子。
而對於Orbitrap質譜儀，離子在裡面飛行的時間可以達到1秒鍾，會飛行非常遠的距離，所以Orbitrap要求-1E-10 mbar這樣的真空度。
離子源系統 ：我們需要把樣品從外界大氣壓的非電離環境中導入質譜儀，變成一個氣態的離子，所以需要一個離子源來實現這個功能。
計算機系統 ：實現質譜儀的控制和數據的採集。
氣體系統 ：氣體供應和廢氣處理（氮氣、氬氣）
電力供應 ：UPS不間斷電源系統
加上核心組件質量分析器，以上就是組成質譜儀的六大系統 。後面我們還會討論每一部分的結構、使用以及維護。
安裝好這六大組件的質譜儀可以用下面的示意圖來表示。通常情況下，質量分析器和高真空的渦輪泵都會裝在一個大盒子里，這個模塊叫主機，而低真空泵（油泵）會放在主機的外面，因為這部分會產生很多的震動、噪音和熱量，需要分開放置，從而防止震動對質譜儀產生的影響。質譜儀前面會有一個離子源，側面會有一個廢氣口，質譜儀和泵產生的廢氣，通過這個排氣管排到室外。尤其是泵產生的廢氣，通常是致癌的，所以排氣尤其重要。
以上討論了如何評估質譜儀的性能、串聯質譜儀的工作原理，以及組成質譜儀的六大組件。下一篇將會聊聊液相色譜儀的構成，以及液質聯用設備的工作原理。
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㈦ 2019-11-12聽課筆記之蛋白質譜的原理及使用（二）
上一篇我跟大夥兒聊了幾種主要的質譜儀的原理及特點，錯過的小夥伴請戳：
接著上次的聽課內容，今天我們來了解一下如何對一台質譜儀的性能進行評估，另外，我還會分享一下串聯質譜是如何工作的。
授課老師
這次課程的授課老師是來自中國農業大學生物學院的李溱老師。李老師於1999年本科畢業於北京師范大學，2007年於美國德克薩斯州Texas A&M大學獲得博士學位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign從事博士後研究。於2011年加入中國農業大學生物學院，任副教授，在植物生理學與生物化學國家重點實驗室及中國農業大學「985」功能基因組中心生物質譜實驗室工作，負責生物質譜實驗室日常運行，對外提供蛋白質組學和代謝組學技術服務，並開展基於高分辨質譜技術的植物代謝組學和蛋白質組學研究工作。李老師對各種質譜儀器的原理、特點及運行維護有著非常豐富的理論積累和實踐經驗，很有幸能邀請到他為我們介紹蛋白質譜的原理和操作。
（文中所有圖片均來自李溱老師的講義，並獲得發表授權。）
質譜儀性能參數
我們作為質譜儀的使用者，怎麼來評估一台質譜儀的性能呢？或者說，我們如何選擇質譜儀呢？質譜儀主要的性能參數如下圖，就讓我來依次為大夥兒解釋一下這些高大上的參數名稱到底是啥意思吧。
檢測限
「官方」的定義是，與三倍噪音相當的物質的量，我們可以理解為這是質譜儀能夠檢測到的最低含量化合物的濃度，或者量。比這個值再低的化合物，這台質譜儀就無能為力了。
我怎麼知道我的質譜儀的檢測限是多少呢？通常，我們會用利血平來作為一個標準的化合物測定質譜儀的檢測限。比如，當我們在質譜儀中注入50 fg（飛克）利血平，如果我們獲得的信噪比能達到100-1000，那麼可以認為這台質譜儀的檢測限是不錯的。50 fg（飛克）利血平中大概只包含了幾萬個利血平分子，也就是說，如果能實現對含有幾萬個小分子的化合物進行檢測，那麼這台質譜儀的靈敏度是挺高的了。大家可以認為，靈敏度與檢測限評估的是同一種性能。
線性范圍
這個性能參數也是挺重要的。它表示在什麼樣的濃度范圍之內，質譜儀檢測到的信號與樣品濃度之間成線性的關系。說得簡單點，就是這個濃度范圍內的樣品，用這台質譜儀檢測是比較合適的，高於或低於這個濃度范圍的樣品，需要濃縮或者稀釋後才能用這台質譜儀檢測。
通常情況下，質譜儀的線性范圍是在3-6個數量級，也就是1,000 – 1,000,000這個范圍之內。大部分質譜儀是在1,000 – 10,000這個范圍內。
這個參數之所以重要，是因為當我們分析的樣品含量分布非常廣的時候，比如有的樣品含量只有幾十μg/ml，而有的樣品含量可以達到幾mg/ml。在這個比較寬的濃度范圍內，如果質譜儀的線性范圍非常好，我們不需要濃縮低濃度的樣品，也不需要稀釋高濃度的樣品，可以直接進樣，這樣可以大大減少樣品前處理的復雜程度，很好地節省時間，節省實驗步驟。
解析度和質量准確度
這是兩個非常重要的參數，我們常說的高分辨質譜，指的就是解析度特別高，且質量准確度特別高。這兩個參數怎麼理解呢？我們先來看看下面這個圖：
解析度
就是質譜儀可以分辨的最近兩個質譜峰的質量差值。
這是啥意思呢？假設我有兩個強度相同的質譜峰，當這兩個峰很靠近的時候，我在什麼情況下可以明確地判斷出這是兩個峰，而不是一個呢？基本准則就是，這兩峰的重疊部分的高度，不超過任何一個質譜峰峰高10%的時候，我們認為這是兩個可分離的峰。反之，如果這兩個峰重疊的部分超過10%，就認為是不可分離的，也就是說，在處理質譜圖時，是沒辦法按照兩個峰值來處理的。
當兩個峰實現10%基線分離時，我們來測定任何一個質譜峰的半峰寬（就是峰高一半處的峰寬），然後用任何一個峰的質荷比除以半峰寬，就可以得到解析度。目前來講，高分辨質譜儀的解析度可以達到50,000-100,000的數量級，一般的四級桿可以達到5,000-10,000。
那麼，高分辨質譜的優點如何體現呢？以上面的右圖為例，當我們用低分辨質譜儀檢測某種物質時，只能得到最外面藍色的一個質譜峰，當我們不斷提高解析度，會慢慢發現，這一個質譜峰裡面，其實包含了若干小的質譜峰，高分辨質譜儀得到的質荷比與低分辨獲得的質荷比是有非常明顯的差異。這對化合物鑒定來講，是很重要的信息。如果我們把質荷比都算錯了，我們是很難鑒定到正確的蛋白的。
下面這個圖也能很直觀地告訴我們質譜檢測高解析度的優勢。
比如說，我們用17,500的解析度來對一個化合物進行掃描，會發現在質荷比在280.09的這個位置，有一個非常胖的質譜峰（第一張譜圖紅色圓圈標記），我們可能會認為這是一個化合物，於是就開始對這個化合物進行鑒定。可是，當我們不斷提高質譜儀的解析度，到一定程度時，我們會發現，這其實是兩個不同的峰（第四張譜圖紅色圓圈標記）。
也就是說，用低解析度質譜里得到的質荷比來鑒定化合物，得到的信息其實是不完全的（不一定是錯的），而通過高分辨質譜，我們就能獲得更全面的化合物信息，幫助我們做出正確的判斷。
質量准確度
是指質譜儀測到的質荷比與它實際的質荷比的差值，除以它真實的質荷比與1,000,000的乘積。所以它是以ppm為單位的（百萬分之一），這個數值看起來更方便。目前高分辨質譜儀質量准確度在2-5個ppm的范圍之內。
那麼，我們怎麼來測定一個質譜儀的實際解析度及質量准確性呢？以李溱老師的一個實驗數據為例：
比如，我們選質荷比是511.6這個峰，計算出它的半峰寬為0.012，於是它的解析度就是511.6除以0.012，得到的值為42,500，而軟體給出的解析度是48,700，是很接近的。
同樣的例子，我們來計算質量准確性。測到的質荷比是511.5978，而這個峰實際的質荷比是511.5995，於是計算出質量偏差為3.3ppm，也就是說此次實驗的誤差就是3.3ppm，這么一個質量偏差范圍通常是可以接受的。
解析度的重要性可能大夥兒容易理解，那質量准確性的高低到底對化合物鑒定會有怎樣的影響呢？我們還是以利血平為例。
利血平分子，在質譜圖中的609.28066處會有一個質譜峰。當我們用單四級桿來分析利血平的時候，單四級桿的質量准確性大約是在0.1個質量單位（165ppm）。也就是說，當把利血平注入一個四級桿質譜中，四級桿質譜會告訴我們，這個化合物的質荷比大概是在609.2-609.4這個范圍之內。
那麼問題就來了！在609.2-609.4范圍內，我們用C、H、O和N四種元素可以組合出多少種在化學上可以存在的化合物呢？答案是：209種！也就是說，我們要判斷這個化合物是不是利血平，得出正確結果的可能性只有1/209！
當我們將質量准確性不斷提高，可以組合出來的可能的化合物就會越來越少。當質量准確性達到3 ppm的時候，只有4種可能的化合物。當達到2 ppm的時候，得到的可能的化合物就只剩下2種了。這時候我們再來判斷化合物是不是利血平，那麼准確性就會高很多很多。這就是為什麼高分辨質譜儀對於化合物鑒定來說非常重要，它可以大大減少候選化合物的數量，提高鑒定的成功率。
可以這么說，解析度與質量偏差分別評估了質譜儀的精密度與准確性。就像我們打靶，比如我每次都能打到右上角一個點上，說明打靶的精密度非常高，但如果我的目標是靶心，那說明准確性卻比較差。另一種情況，比如我打靶很多次，打中的點很分散，東一槍西一槍，但平均起來的位置剛好在靶心上，可以認為質量准確性還可以，但精密度比較差。所以我們希望的是，質譜儀的精密度和准確性都非常高。
目前我們能用到的高分辨質譜儀，不管是QTOF或者Orbitrap系列，都可以達到50,000以上的解析度，同時也可以達到2-3ppm的質量准確性。所以說，如今做蛋白質組學研究的童鞋們，比起以前，真是幸福了很多！
前面給大夥兒分享了評估質譜儀的幾個重要參數。那接下來我們就針對不同質譜的性能做一個粗略的總結。
1、 四級桿和離子阱：它們的質量掃描范圍是有限的，通常情況下是在10-4,000。超過4,000，四級桿和離子阱就只能作為離子傳輸用，而不能用於離子檢測了。它們的解析度通常是2,000-4,000，好一點的離子阱可以達到10,000-20,000。掃描速度都不是很快，它們的優勢是價格非常低，而且整個儀器可以做得非常小。
2、 TOF：它最大的優勢是可以測量的質量范圍理論上可以無限大和無限小。如果待檢測的離子沒有質量，那麼它的飛行時間將是0，於是可以測到質荷比是0的離子。同理，如果離子的質量是無限大的，那麼它的飛行時間也是無限長的，理論上也是可以檢測的。TOF的解析度是5,000-60,000，掃描速度非常快，它的缺點是，TOF需要一個非常長的離子跑道，所以儀器的體積會很大。
3、 FTICR：優勢是解析度非常高，可以達到1,000,000甚至更高，缺點是掃描速度比較慢，而且它需要一個超導磁鐵，運行費用非常高，而且FTICR質譜儀本身的價格也很高，通常都在100萬美元以上。
4、 Orbitrap：克服了FTICR必須要使用超導磁鐵的缺點，它的解析度可以達到100,000到1,000,000萬，掃描速度不是很快，價格比FTICR要低一些。它受專利保護，目前只有Thermo公司可以生產。
對於蛋白質組學研究來講，我們對質譜儀器性能的最低要求是：解析度至少在40,000-50,000，質量准確性應該優於5ppm，質量掃描范圍應該在100-3,000，掃描速度是每秒至少獲得一張高分辨的一級譜圖和十張高分辨的二級譜圖。達到以上條件的話，就算是滿足了我們做蛋白質組學最基本的要求。
串聯質譜
上面講到各種質譜儀的優缺點，那麼我們這里引入串聯質譜的概念：將相同或者不同的質譜儀串聯起來，實現串聯或者並聯工作。這樣做的目的有兩個：產生二級碎片離子（為什麼要產生二級碎片離子我們後來會講），以及實現不同質譜儀性能的優勢互補。
我們知道，不同的質譜儀性能是不同的。比如說，四級桿質譜可以實現離子選擇，但它的解析度比較差，而TOF不能實現離子的選擇，但解析度比較高。那麼我們能不能把不同性能的質譜儀串到一起，讓它們協同工作呢？我們通常會利用串聯質譜或者MS-MS來實現這個需求。它們的結合方式有很多種：
第一種：三重四級桿（Triple Quadrupole），或者串聯四級桿，就是把三個四級桿串聯起來，這樣做的主要目的是為了實現二級質譜的掃描。
第二種：四級桿和飛行時間質譜儀串聯到一起，就是我們經常聽到的Q-TOF，它實際上是為了提高二級質譜的解析度。
第三種：Orbitrap與四級桿組合，比如Orbitrap Fusion，或者Orbitrap與離子阱組合到一起，比如說Orbitrap Elite等，就是這樣的組合。
首先，我們聊一聊怎麼通過串聯質譜儀獲得二級碎片離子。
上面是一個串聯四級桿結構的示意圖。串聯四級桿，或者叫三重四級桿，它是由三個四級桿串聯起來。通常，第二個四級桿是由六級桿或八級桿來代替，但我們還是叫它四級桿。這個四級桿不是一個質量選擇系統，而是一個collision cell，即碰撞池，用來碎裂離子。
當串聯四級桿工作的時候，第一個四級桿是開啟了質量選擇的模式，它讓特定質荷比的離子穿過質譜儀，而把其它的離子都甩掉（甩到四級桿上，或者甩到四級桿的空間當中去）。然後，當特定的離子被選擇好後（稱為母離子），會進入碰撞池。
在碰撞池裡有這樣一個結構，就是入口和出口存在電壓差，通常入口電壓會高於出口電壓，當母離子進來以後，通過電壓差的作用，就會被加速。而且碰撞池裡會充上氦氣或氮氣，當離子被加速以後，它就會與碰撞池裡的氦氣或氮氣分子發生碰撞、碎裂，形成一些碎片，叫做fragment ions，也就是碎片離子，或者子離子。這些碎片離子會進到第三個四級桿中，進行二級的掃描，得到二級質譜圖。
下圖就是一個串聯四級桿質譜儀，我們可以看到，它仍然是一個非常緊湊的結構。
三重四級桿
我們以萊克多巴胺為例，來看看它的分子通過串聯質譜儀，會發生哪些變化，得到怎樣的譜圖。
萊克多巴胺這是一種獸葯。它的分子量是301.1672，結構式見上圖。第一張圖，測出來的質荷比為302.1744，這是一個一級質譜的掃描圖，在302.1744處有一個萊克多巴胺的質譜峰。
然後呢，我們告訴質譜儀，把302.1744處的這個離子挑出來，將CID（碰撞誘導解離）電壓設為10伏，即在碰撞池的入口與出口處增加一個10V的電壓差，讓離子以10V的碰撞能來進行碰撞。碰撞以後，在第二張圖里，我們看到302處的信號強度變弱了，同時284和164的信號強度變強了，原來沒有看到的107、121、136信號也出現了。
接下來，我們把碰撞電壓從10V增加到25V，增加以後我們會發現，302處的信號完全消失了，表明原來在第一個四級桿中被選擇出來的這個離子，經過高能量的碰撞後，完全碎裂了，碎成了91、107、121、136和164這樣一些碎片離子。那麼這些碎片離子都是什麼呢？
我們通過分析結構會發現，它們分別對應著萊克多巴胺的不同的碎片結構，比如164其實對應著萊克多巴胺右端的局部，136對應的是左半部分，等等。
通過分析碎片的化學結構，我們就可以把它們拼裝起來，拼成一個完整的萊克多巴胺分子。這就是我們如何通過二級質譜圖，來實現對化合物的結構鑒定。而實際的鑒定過程常常會更復雜更傷腦筋一些，上面只是一個簡單的示例。
那麼對於多肽，或者說對於蛋白酶解後的多肽片段來說，我們可以通過同樣的過程，通過分析一個多肽理論上可以得到哪些碎片，然後與譜圖進行對比，就可以實現對多肽序列的鑒定。這部分後面會詳細再講。我們先來看個簡單的例子，如下圖：
比如說我們有左上角這樣一個肽段，理論上可以得到灰色標記出的各種b-y離子，通過分析質譜圖，可以從中找到對應的碎片離子（右邊表格里紅色標記的都是可以從質譜圖中找到的碎片離子），通過將這些信息拼裝起來，我們就可以知道多肽的序列是什麼。
上面通過以三重四級桿為例，跟大夥兒分享了串聯質譜儀是如何獲取二級碎片離子及二級譜圖的。那麼，其它一些串聯質譜儀也是類似的過程。
Q-TOF
Q-TOF與串聯四級桿其實是非常像的，只不過它把第三個四級桿換成了一個飛行時間質譜儀。也就是說，一個四級桿，接一個碰撞池，然後接一個飛行時間質譜儀。為了增加飛行的距離，我們會讓離子拐個彎再飛回來，這種叫反射模式飛行，讓離子在更短的空間內可以飛得更遠一些。
下面這個圖就是一個Q-TOF質譜儀，是Bruker生產的。它的飛行時間管（flight tube）的長度可以達到3.6米，離子飛一個來回是7.2米。這個數字大夥兒可以留意一下，後面在講真空度的時候，還會再次提到。
Orbitrap系列
Orbitrap系列比一般的串聯質譜儀要復雜一些，大夥兒可以通過下面這個示意圖感受一下。
這個系列有好幾種串聯質譜儀，比如Q Exactive質譜儀，它的Q1也是一個四級桿，Q2是碰撞池，Q3是被一個Orbitrap所取代。
再比如Orbitrap Elite，它的Q1是一個離子阱，Q2是一個碰撞池，Q3為一個Orbitrap，也就是說，Orbitrap Elite裡面是沒有四級桿的，它用一個離子阱代替了四級桿。
還有一款是Orbitrap Fusion（見下圖），它是三種質譜儀混在一些的組合，它的第一級是四級桿，第二級是一個離子阱，第三級是一個Orbitrap，同時它還有一個碰撞池，整體是一個非常復雜的結構。它的特點是，Orbitrap與離子阱可以同步進行掃描。
一般的質譜儀里，兩個質量檢測量是不能同時掃描的，只能是一個作為質量檢測的功能，另外一個作為過濾用。而Orbitrap Fusion里的離子阱和Orbitrap是同時可以進行掃描的，也就是說，它是一個並列的結構，而不僅僅是串聯的，所以它的掃描速度會更快，性能也更好。Fusion的解析度可以達到240,000 – 960,000。
上面我分享了幾種常用的質譜儀，那麼以Q-TOF為例，我們再來學習一下質譜儀的基本構造。
對於質譜儀來說，最核心的部分就是質量分析器，它包括兩個部分，就是前面我們詳細介紹的質量過濾器和質量檢測器。質譜儀所有其它部分都是為這個核心部分來服務的。
除了這個核心的組件以外，質譜儀還需要以下幾個部分輔助：
質譜輔助系統
真空系統：為什麼需要有真空系統呢？我們知道，質譜儀是一台檢測氣態離子質荷比的儀器，當一個氣態離子在空氣中飛行時，它會與空氣分子發生碰撞，它帶的電荷可能就會被撞沒了，而成為一個不帶電荷的氣態分子，那麼質譜儀就無法再測量它的質荷比了。所以我們希望得到的這個氣態離子能夠在質譜儀中穩定存在，所以質譜儀需要一個真空系統，讓離子可以穩定地飛行，不受其它空氣分子的干擾。
真空系統通常需要有兩級，一級是低真空，由機械泵或油泵來提供，它可以大概1-3個mbar，也就是千分之一個大氣壓的壓力環境，低真空的目的是為了給高真空提供一個後備壓力環境。高真空是用渦輪泵來提供的，它的真空程度是-1E-5~-1E-10 mbar，在這樣一個真空環境里，空氣分子基本上都被抽干凈了。
可能你想問，為什麼要求這個數量級的真空條件呢？
我們先引出一個概念，叫離子的平均自由程（mean free path），它的意思是，一個離子在一個真空環境中飛行多長的距離會碰到下一個空氣分子。這就決定了離子在真空中可以穩定存在多久。
以串聯四級桿為例，串聯四級桿質譜儀大概有1米長左右，所以我們希望離子在飛行1米的過程中，不要碰到其它的空氣分子。那麼對於串聯四級桿來講，只要維持的真空度能保證1米距離內不會碰到空氣分子就可以了。所以串聯四級桿通常只需要-1E5 mbar的真空度。
而對於Q-TOF來說，離子的飛行距離大概是在5-7米（大夥兒還記得嗎？前面介紹Q-TOF時專門提到了7米這個飛行距離），比串聯四級桿的飛行距離長了將近一個數據級，所以Q-TOF質譜儀要求的真空度大約在-1E-6 ~ -1E-7 mbar，才能保證離子在飛行這么長的過程中，不會碰撞到其它空氣分子。
而對於Orbitrap質譜儀，離子在裡面飛行的時間可以達到1秒鍾，會飛行非常遠的距離，所以Orbitrap要求-1E-10 mbar這樣的真空度。
離子源系統：我們需要把樣品從外界大氣壓的非電離環境中導入質譜儀，變成一個氣態的離子，所以需要一個離子源來實現這個功能。
計算機系統：實現質譜儀的控制和數據的採集。
氣體系統：氣體供應和廢氣處理（氮氣、氬氣）
電力供應：UPS不間斷電源系統
加上核心組件質量分析器，以上就是組成質譜儀的六大系統。後面我們還會討論每一部分的結構、使用以及維護。
安裝好這六大組件的質譜儀可以用下面的示意圖來表示。通常情況下，質量分析器和高真空的渦輪泵都會裝在一個大盒子里，這個模塊叫主機，而低真空泵（油泵）會放在主機的外面，因為這部分會產生很多的震動、噪音和熱量，需要分開放置，從而防止震動對質譜儀產生的影響。質譜儀前面會有一個離子源，側面會有一個廢氣口，質譜儀和泵產生的廢氣，通過這個排氣管排到室外。尤其是泵產生的廢氣，通常是致癌的，所以排氣尤其重要。
今天我分享了課程中學習到的如何評估質譜儀的性能、串聯質譜儀的工作原理，以及組成質譜儀的六大組件，大夥兒是否都清楚了呢？如果有什麼問題，請給我們留言吧。下一篇我將會聊聊液相色譜儀的構成，以及液質聯用設備的工作原理